Laboratorijska analiza – određivanje S-alilcisteina U uzorcima “Zlatnog Alliuma”

(pomoću Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC), 2015.)

 

Uzorci

(*)S-alilcistein (SAC) standard (SML0337, u prahu, >98% čistoće) je kupljen od Sigme. Njegova kemijska formula je:

(*)Uzorci A i B su iz “Zlatnog Alliuma” proizvedenog u OPG Nenad Ivanković. “Kyolic AGE” je proizvod s tržišta u SAD.

 

Instrumentacija i metoda

Analize su izvršene u Odjelu za farmaceutiku i farmaceutsku kemiju Sveučilišta u Utah-u, Salt Lake City, SAD. Agilent Technologies 1100 HPLC sustav opremljen s DAD (Diode Array Detector) i C18 kolonom (Agilent Eclipse XDB-C18, 5 µm, 4.6 x 250 mm) korišten je za separaciju komponenata i njihovu detekciju. Korištena je metoda gradijenta eluensa s dvije otopine:

Pufer A: destilirana H2O s 0,1% trifluoro-octenom kiselinom (pH 2,1) Pufer B: acetonitril s 0.1% trifluoro-octenom kiseline (pH 2,1) Za samu analizu korišten je gradijent postupak prikazan u tabeli:

 

Priprema uzoraka i analize

S-alilcistein (SAC) standard je otopljen u 1: 1 (v / v) smjesi metanola i pufera A tako da mu je koncentracija bila 1 mg/mL. Otopina je filtrirana kroz 0.22 µm filter. Dobiveni filtrat je unesen u C18 kolonu pomoću Agilent automatskog uređaja (volumen unosa = 20 µL). Detekcija je vršena u UV području kod 208 nm i 220 nm. Dva uzorka “Zlatnog Alliuma” (svaki od 100 µL) su razrijeđeni s 200 µL pufera A + 100 µL pufera B. Nakon miješanja i centrifugiranja (16100 rpm x 6 min) stvoreni talog je odfiltriran i dobiveni filtrat je analiziran kao što je opisano gore. Talozi nisu bili topivi u etanolu ili u 20% otopini etanola i nisu dalje analizirani. Volumen ubrizgavanja uzoraka “Zlatnog Alliuma” u C18 kolonu bio je 20 µL za svaki uzorak.

“Kyolic AGE” uzorak (20 µL) je razrijeđen s 200 µL pufera A + 100 µL pufera B. Volumen ubrizgavanja u C18 kolonu bio je 10 µL.

 

Rezultati

RP-HPLC profil svježe pripremljenog standarda S-alilcisteina pokazao je jednu komponentu (Slika 1 na kojoj se vidi “doublet peak” čiji se maksimum nalazi na oko ~ 5,9 minute elucije).


Slika 1. RP-HPLC profil SAC standarda

Dva filtrata “Zlatnog Alliuma” pokazali su identične profile elucije s nekoliko vrhova (“peak”-ova), među kojima se nalazio i vrh kod ~ 6,0 minute elucije što odgovara S-alilcisteinu (Slika 2).


Slika 2. RP-HPLC profili dva uzorka “Zlatnog Alliuma”. Strelice iznad gornjeg profila označuju položaj glavnih komponenata u tim uzorcima

Za usporedbu, RP-HPLC profil komercijalnog uzorka je pokazao vrlo sličan profil elucije kao i uzorci “Zlatnog Alliuma” (Slika 3). To ukazuje da se u uzorcima “Zlatnog Alliuma” nalaze identične komponente kao i u komercijalnom uzorku “Kyolic AGE”. Treba napomenuti da su vrhovi u profilu Kyolic AGE superpozirani na širokoj pozadini koja (prema literaturi) proističe od dodane karamel boje.


Slika 3. RP-HPLC profil komercijalnog uzorka.

Da se isključi mogućnost utjecaja otapala u profilima “Zlatnog Alliuma” (20% vodena otopina etanola), dodatna RP-HPLC analiza je uključila i 20% etanol za kojeg se našlo da jedino ima vrlo mali negativan minimum kod 3,2 minute elucije pod istim uvjetima i koji prema tome nema bilo kakav značajni doprinos HPLC profilima “Zlatnog Alliuma”.

 

Preliminarno određivanje količine S-alilcisteina SAC

Ukupna količina standarda SAC-a unesena u C18 kolonu je bila 20 µL x 1 µg/µL = 20 µg, i ta je količina pokazala maksimum od ~200 mAU kod ~ 5,9 minutne elucije (tj. 200 jedinica UV detektora kod 220 nm). Prema tome 10 mAU u profilu kod ~ 6 minutne elucije odgovara 1 µg SAC-a u uzorku unesenom na C18 kolonu. Kod uzoraka “Zlatnog Alliuma” visina maksimuma (iznad pozadine) kod ~ 6 min elucije bila je 70 mAU što odgovara količini SAC-a od 7 µg u svakom od dva uzorka (Slika 2). Pošto je ubrizgan volumen bio 20 µL a faktor razrjeđenja je bio 4 ((300 µL pufera + 100 µL uzorka) /100 µL uzorka), ukupna koncentracija SAC-a u uzorcima “Zlatnog Alliuma” je oko 1.4 g/L.

 

Dodatak

U komercijalnom uzorku (Kyolic AGE) je zbog dodane karamel boje bilo teže odrediti točnu koncentraciju SAC-a jer RP-HPLC profilom dominira široki maksimum karamel boje. Vrh u profilu kod ~ 5.9 min elucije (što odgovara SAC-u) iznosio je ~10 mAU (Slika 3), što bi značilo da u ubrizganom volumenu od 10 µL ima 1 µg SAC-a, a pošto je faktor razrjeđenja bio 16 ((300 µL pufera + 20 µL uzorka)/20 µL uzorka), približna koncentracija SAC-a u komercijalnom uzorku iznosila oko ~1.6 g/L.

 

Napomena

Ekstrakt se standardizira prema količini S-alilcisteina (SAC). S obzirom da je za proizvod od češnjaka najvažnija fitokemikalija SAC iz navedene analize je vidljiva količina SAC-a u Zlatnom Alliumu u odnosu na standard koji je 99% suha tvar SAC-a. Kad se izračuna količina (površina koju omeđuje pik – vrh grafikona) analiza pokazuje ove rezultate: Zlatni Allium ima oko 1,4 g SAC-a na litru, a Kyolic ima oko 1,6 g SAC-a na litru. Zlatni Allium je po količini najvažnije fitokemikalije SAC po kojoj se proizvod standardizira jednako kvalitetan kao i globalno prisutan Kyolic.